アプリケーションノート

Vol.1 | ヒト培養脂肪細胞の分化に伴う遺伝子発現変動の検出

神戸大学大学院医学系研究科
糖尿病代謝・消化器・腎臓内科学研究室
阪上 浩先生 ご提供

3D-Gene Human Immunity & Metabolic Syndrome 9kは、ヒトの免疫およびメタボリックシンドロームに関連すると想定されている遺伝子、約9000種類を搭載した高感度DNAチップです。本チップを用いてヒト培養脂肪細胞の分化誘導前後の遺伝子発現を測定し、特に低発現遺伝子の変動についてその検出力を検討しました。

検出対象

ヒト培養脂肪細胞(内臓脂肪、Poietics™ Human Visceral Preadipocyte、CAMBREX社)について、分化誘導前の細胞および10日間分化誘導した細胞(添付プロトコール法による)からそれぞれ total RNAを抽出し、NanoDrop(ThermoFisher社)によりOD260、OD280を測定し、OD比>1.8であることを確認した。

ヒト培養脂肪細胞の分化誘導

図1 ヒト培養脂肪細胞の分化誘導

細胞を10%中性ホルマリンで固定後にOil Red Oで染色した(Sakaue Hら、Genes Dev. 2002;16(8):908-912.)。脂肪が赤色に染まっていることが確認される。写真撮影はBZ-8000 inverted fluorescence and phase-contrast microscope (Keyence Co., Osaka, Japan)で実施した。
(Total RNAおよび写真:神戸大学大学院医学系研究科 糖尿病代謝・消化器・腎臓内科学研究室阪上先生ご提供)

結果

ヒト脂肪細胞の分化誘導に伴う遺伝子発現変化縦軸:M値、横軸:A値図2 ヒト脂肪細胞の分化誘導に伴う遺伝子発現変化
縦軸:M値、横軸:A値

分化誘導前のヒト培養脂肪細胞由来aRNAをCy5、分化誘導後の細胞由来aRNAをCy3で標識し、競合ハイブリダイズを行った。蛍光強度を指標として有効スポットのみを抽出し、蛍光値についてglobal normalizationを実施したのちにM、A値を計算した(図2)。「3D-Gene Human Immunity & Metabolic Syndrome 9k」に搭載した8953遺伝子中341種の遺伝子についてM値が1.3以上、または-1.3以下の変動を示した。また139種の遺伝子についてM > 2またはM < -2(表1)、79種についてM > 3またはM < -3であった。分化誘導後に新たに発現が検出された遺伝子は22種であった。M > 3またはM < -3の遺伝子について、細胞内情報伝達系を解析可能なPathwayStudio(AriadneGenomics社)を用いてその相関関係を検索した結果を図3に示す。
これらの遺伝子について、タンパク質間結合、発現制御、修飾などの相互の情報が検出され、脂肪細胞の分化に伴って遺伝子発現の変動に伴う細胞内情報伝達系のダイナミックな変化が起こっている可能性が示唆された。すなわち、「3D-Gene Human Immunity & Metabolic Syndrome 9k」による遺伝子発現変動の測定によって、細胞内情報伝達系の変化が検出可能であることが示された。(PathwayStudioの製品および商用解析はインフォコム株式会社によって提供されています。)

ヒト培養脂肪細胞の分化誘導に伴う発現変動遺伝子の細胞内機能相関図

図3 ヒト培養脂肪細胞の分化誘導に伴う発現変動遺伝子の細胞内機能相関図

分化誘導前の細胞由来aRNAをCy5、誘導後の細胞由来aRNAをCy3で標識し、競合ハイブリダイズを行った。M値3以上または-3以下の遺伝子についてPathwayStudioによって、その相関関係(最も短いパスウェイのみを表示)を示した。緑のタンパク質は分化に伴い減少した遺伝子、赤は増加した遺伝子を示す。発現変動した遺伝子のうち、パスウェイに連結されなかった遺伝子は除いた。分子間の相互関係を示す線のうち、紫線はタンパク質間結合、灰色線は何らかの制御の存在を示す。

表1 ヒト培養脂肪細胞において分化誘導により発現変動する遺伝子群(M<-2、M>2)

GeneName M値 description GeneName M値 description
C8orf21 7.52 XK-related protein 6 ALDH2 2.45 Aldehyde dehydrogenase, mitochondrial
LHX6 7.09 LIM/homeobox protein Lhx6.1 AKR1B10 2.42 Aldo-keto reductase family 1 member B10
CHI3L2 6.54 Chitinase 3-like protein 2 precursor (YKL-39) WDR45L 2.42 WD repeat domain phosphoinositide-interacting protein 3
RBP4 6.50 Plasma retinol-binding protein SRPX 2.42 Sushi repeat-containing protein SRPX
SCARF1 6.07 Endothelial cells scavenger receptor precursor (Acetyl LDL receptor) CD302 2.41 CD302 antigen
AKR7A3 5.94 Aflatoxin B1 aldehyde reductase member 3 DLAT 2.39 Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component of pyruvate dehydrogenase complex, mitochondrial
CIDEC 5.81 Cell death activator CIDE-3 AKR1C2 2.38 Aldo-keto reductase family 1 member C1
GPX3 5.76 Glutathione peroxidase 6 PF4 2.36 Platelet factor 4
HP 5.65 Haptoglobin CDC20 2.34 Cell division cycle protein 20 homolog
HP 5.52 Haptoglobin TMEM37 2.34 Voltage-dependent calcium channel gamma-like subunit
ULBP2 4.72 NKG2D ligand 2 CORIN 2.27 Atrial natriuteric peptide-converting enzyme
ADIPOQ 4.72 Adiponectin ACAT1 2.26 Acetyl-CoA acetyltransferase, mitochondrial
PRG4 4.71 Proteoglycan-4 PDGFRA 2.26 ALPHA PLATELET-DERIVED GROWTH FACTOR RECEPTOR
SCD 4.70 Acyl-CoA desaturase FNDC6 2.22 Interleukin-20 receptor beta chain
LIPE 4.67 Hormone-sensitive lipase SEPP1 2.19 CH5400
ADH1A 4.56 Alcohol dehydrogenase 1A CDKN2C 2.19 Cyclin-dependent kinase 6 inhibitor
APOE 4.54 Apolipoprotein E (Apo-E) FACL5 2.18 Long-chain-fatty-acid--CoA ligase 5
TF 4.49 Serotransferrin (Transferrin) ADAMTS2 2.17 ADAMTS-2
STCH 4.40 Stress 70 protein chaperone microsome-associated 60 kDa protein AOC3 2.15 Membrane copper amine oxidase
FKBP5 4.39 FK506-binding protein 5 WFDC1 2.15 WAP four-disulfide core domain protein 1
GPAM 4.26 Glycerol-3-phosphate acyltransferase, mitochondria CHST2 2.15 Carbohydrate sulfotransferase 2
PDK3 4.21 [Pyruvate dehydrogenase [lipoamide]] kinase isozyme 3, mitochondrial SCGB1D2 2.14 Lipophilin-B
WDR4 4.20 WD repeat protein 4 LGALS12 2.13 Galectin-12
TIMP4 4.19 Metalloproteinase inhibitor 4 A2M 2.11 Alpha-2-macroglobulin
DGAT2 4.18 diacylglycerol O-acyltransferase homolog 2 MGST1 2.11 Microsomal glutathione S-transferase 1
KLHL5 4.16 Kelch-like protein 5 PSTPIP1 2.11 Proline-serine-threonine phosphatase-interacting protein 1
LBP 4.09 Lipopolysaccharide-binding protein CDC42BPA 2.10 Serine/threonine-protein kinase MRCK alpha
ADH1B 4.02 Alcohol dehydrogenase 1B KIR2DS2 2.10 Killer cell immunoglobulin-like receptor 3DL2
PRKAR2B 3.96 cAMP-dependent protein kinase type II-beta regulatory subunit KIF20A 2.09 Kinesin family member 20A (Rabkinesin-6)
GLUL 3.95 Glutamine synthetase CHRNA2 2.08 Neuronal acetylcholine receptor protein, alpha-2 subunit
FABP5 3.92 Fatty acid-binding protein, epidermal ACAT2 2.07 Acetyl-CoA acetyltransferase, cytosolic
ARC 3.92 activity-regulated cytoskeleton-associated protein CSF2RB 2.06 Cytokine receptor common beta chain
CLCA2 3.91 calcium activated chloride channel 2 MT1L 2.06 Metallothionein-1X
TMC5 3.83 transmembrane channel-like 5 CHODL 2.03 Chondrolectin
DSIPI 3.75 TSC22 domain family protein 3 AKR1C4 2.02 Aldo-keto reductase family 1 member C4
EEF1A1 3.74 Elongation factor 1-alpha 1 NR1H3 2.02 Oxysterols receptor LXR-alpha
GPM6B 3.66 Neuronal membrane glycoprotein M6-b CTLA4 2.00 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4
CD36 3.64 Platelet glycoprotein 4 ND1 -2.06 NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 6
FACL1 3.63 Long-chain-fatty-acid--CoA ligase 1 BDNF -2.07 Brain-derived neurotrophic factor
STK22C 3.62 Testis-specific serine/threonine-protein kinase 3 TOP2A -2.13 Isoform 2 of P11388
CCL21 3.55 Small inducible cytokine A21 HTR2A -2.15 5-hydroxytryptamine 2A receptor
NM_015393 3.48 Protein PARM-1 TPD52L1 -2.18 Tumor protein D53
IL1RL1 3.30 Interleukin-1 receptor-like 1 RARRES2 -2.20 Retinoic acid receptor responder protein 2
ITM2A 3.25 Integral membrane protein 2A (E25 protein) CPXM2 -2.25 Carboxypeptidase-like protein X2
HSD11B1 3.25 Corticosteroid 11-beta-dehydrogenase isozyme 1 ANKRD37 -2.34 Ankyrin repeat domain-containing protein 37
PLIN 3.15 Perilipin LOXL4 -2.39 Lysyl oxidase homolog 4
RASAL2 3.14 Ras GTPase-activating protein nGAP HSPA8 -2.48 Heat shock cognate 71 kDa protein
ABCC2 3.13 Canalicular multispecific organic anion transporter 1 CHI3L1 -2.52 Chitinase-3-like protein 1
CRISPLD2 3.08 cysteine-rich secretory protein LCCL domain containing 2 OCIAD2 -2.54 OCIA domain containing 2 isoform 2
DF 3.05 Complement factor D IER3 -2.57 Radiation-inducible immediate-early gene IEX-1
NETO2 3.03 Neuropilin and tolloid-like protein 2 FST -2.73 Follistatin
KNTC2 3.03 kinetochore associated 2 CPA4 -2.95 Carboxypeptidase A4
MAGEA10 2.98 Melanoma-associated antigen 10 CCL11 -3.04 Eotaxin
ABCD2 2.95 ATP-binding cassette sub-family D member 2 BDKRB1 -3.42 B1 bradykinin receptor
GPR37L1 2.95 Endothelin B receptor-like protein 2 MMP1 -3.45 Interstitial collagenase
CPM 2.85 Carboxypeptidase M MXRA5 -3.53 adlican [Source:RefSeq_peptide
PKD1L2 2.85 polycystin 1-like 2 isoform IL6 -4.21 Interleukin-6
RAB40A 2.85 Ras-related protein Rab-40A LPL 誘導
により
発現
Lipoprotein lipase
FIGF 2.83 Vascular endothelial growth factor D CEBPA CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), alpha
PRL 2.80 Prolactin BZW2 basic leucine zipper and W2 domains 2
NPR1 2.79 Atrial natriuretic peptide receptor A LRRC7 Leucine-rich repeat-containing protein 7
APOC1 2.78 Apolipoprotein C-I AQP7 Aquaporin-7
ITIH1 2.77 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1 GPD1 Glycerol-3-phosphate dehydrogenase [NAD+], cytoplasmic
G0S2 2.77 Putative lymphocyte G0/G1 switch protein 2 HS2ST1 heparan sulfate 2-O-sulfotransferase 1
WBSCR14 2.72 Williams-Beuren syndrome chromosome region 14 protein ACVR1C Activin receptor type 1C
INADL 2.71 InaD-like protein DUSP4 Dual specificity protein phosphatase 4
NRCAM 2.70 Neuronal cell adhesion molecule WNT11 Protein Wnt-11
TAC1 2.69 Protachykinin 1 IRF4 Interferon regulatory factor 4
PTN 2.65 Pleiotrophin KCNS2 Potassium voltage-gated channel subfamily S member 2
ARRB1 2.65 Beta-arrestin-1 HSH2D Hematopoietic SH2 domain-containing protein
CLDN18 2.62 Claudin-18 GPR112 Probable G-protein coupled receptor 112
MAOA 2.59 Amine oxidase [flavin-containing] A PLUNC Protein Plunc
S100A5 2.57 Protein S100-A5 SLC6A20 Sodium- and chloride-dependent transporter XTRP3
MATN2 2.55 Matrilin-2 NALP14 NACHT, LRR and PYD-containing protein 14
PDCD10 2.53 Programmed cell death protein 10 LY75 Lymphocyte antigen 75
AOX1 2.52 Aldehyde oxidase BMP5 Bone morphogenetic protein 5
GPBAR1 2.50 G-protein coupled bile acid receptor BG37 [ SLA SRC-like-adapter
FBN2 2.46 Fibrillin-2 KRTAP6-2 Keratin-associated protein 6-2.
CYP4F3 2.45 CYTOCHROME P450 4F3 CDC45L CDC45-related protein
LAMA3 2.45 Laminin alpha-3 chain

低発現遺伝子の変動検出

3D-Gene Human Immunity & Metabolic Syndrome 9kは従来のDNAチップに比べて高感度であり、発現量が少ない遺伝子についても発現変動を検出することが可能である。そこで、ヒト培養脂肪細胞においても特に発現が低い遺伝子群について注目した。有効スポットと判定された遺伝子についてA値(発現量の目安、図2横軸を参照)平均6以下のものを抽出したところ112種が該当した。さらにこれらについてM値変動が1.3以上のものが56種検出された(表2)。これらの中には従来脂肪細胞分化との関連が示唆されてきたGPR40や、EDNRAなどの受容体、CLCA2などのチャネル・トランスポーターが含まれており、GPCRを始めとした低発現遺伝子の変動を鋭敏に検出していることが示された。

表2 発現変動が検出された低発現遺伝子

Symbol M A description Symbol M A description
CLCA2 3.90 5.71 calcium activated chloride channel 2 RBMY1C 1.93 5.30 RNA-binding motif protein, Y chromosome, family 1 member A1
IL1RL1 3.28 5.26 Interleukin-1 receptor-like 1 precursor BIRC8 1.87 5.20 Baculoviral IAP repeat-containing protein 8
ABCC2 3.12 5.95 Canalicular multispecific organic anion transporter 1 ZFP37 1.86 5.22 Zinc finger protein 37 homolog
NETO2 2.98 4.70 Neuropilin and tolloid-like protein 2 ICA1 1.83 5.43 Islet cell autoantigen 1
KNTC2 2.92 5.42 kinetochore associated 2 BC002353 1.80 5.74 Probable G-protein coupled receptor 162
MAGEA10 2.87 5.02 Melanoma-associated antigen 10 CNR2 1.76 5.34 Cannabinoid receptor 2
ABCD2 2.83 5.29 ATP-binding cassette sub-family D member 2 CYP11B2 1.74 5.41 Cytochrome P450 11B2, mitochondrial
GPR37L1 2.81 5.55 Endothelin B receptor-like protein 2 EDNRA 1.73 5.55 Endothelin-1 receptor
ITIH1 2.64 5.32 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1 KIT 1.70 5.67 Mast/stem cell growth factor receptor
TAC1 2.62 5.03 Protachykinin 1 CCNA2 1.68 5.25 Cyclin-A2
CLDN18 2.60 5.17 Claudin-18. GLI 1.65 5.67 Zinc finger protein GLI1
ARRB1 2.57 5.85 Beta-arrestin-1 SERPINA9 1.65 5.36 Serpin A9
PDCD10 2.51 5.04 Programmed cell death protein 10 HES4 1.63 5.98 Transcription factor HES-4
S100A5 2.49 4.92 Protein S100-A5 FOS 1.61 5.63 Proto-oncogene protein c-fos
CYP4F3 2.44 5.40   RASL11B 1.61 5.96 RAS-like family 11 member B
GPBAR1 2.39 5.61 G-protein coupled bile acid receptor BG37 POLR3F 1.56 5.36 DNA-directed RNA polymerase III 39 kDa polypeptide
INADL 2.33 5.66 InaD-like protein PTPRS 1.55 5.94 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase S
CORIN 2.26 5.61 Atrial natriuteric peptide-converting enzyme GPR40 1.55 5.58 Free fatty acid receptor 1
CDC20 2.24 5.55 Cell division cycle protein 20 homolog CILP 1.54 5.67 Cartilage intermediate layer protein 1
SCGB1D2 2.09 5.75 Lipophilin-B RETN 1.51 5.64 Resistin
PSTPIP1 2.07 5.16 Proline-serine-threonine phosphatase-interacting protein 1 CHAF1A 1.42 5.49 Chromatin assembly factor 1 subunit A
KIR2DS2 2.05 5.26 Killer cell immunoglobulin-like receptor 3DL2 SLC4A1 1.41 5.24 Band 3 anion transport protein
CDC42BPA 2.03 5.83 Serine/threonine-protein kinase MRCK alpha TNNI1 1.41 5.86 Troponin I, slow skeletal muscle
CSF2RB 2.01 5.51 Cytokine receptor common beta chain TREM2 1.39 5.29 Triggering receptor expressed on myeloid cells 2
KIF20A 2.00 5.43 Kinesin family member 20A TMEM67 1.37 5.72 Meckelin
CTLA4 2.00 5.77 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 CYP3A5 1.34 5.89 Cytochrome P450 3A5
CHODL 1.99 5.46 Chondrolectin SOS2 1.32 5.77 Son of sevenless homolog 2
PHOSPHO1 1.94 5.41 Phosphoethanolamine / phosphocholine phosphatase PFN4 1.32 5.61 Profilin-4

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